细胞复苏的成功与否与冻存及复苏操作息息相关。上周我们讨论了细胞冻存过程中常见的错误，详细内容在《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》中。本篇文章将从复苏的角度分析复苏过程中容易出现的问题。

复苏步骤回顾：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，让培养基复温，并设置好离心机的转速；

2. 准备一个15ml离心管，加入适量培养基；

3. 从液氮中取出冻存管，快速浸入水浴锅，并摇晃使细胞在2分钟内完全融化；

4. 将细胞悬液缓慢滴入事先准备好的培养基离心管中，进行1000rpm离心3分钟；

5. 弃去上清，重悬细胞并接种到培养器皿中，放入培养箱。

复苏常见错误操作：

1. 若液氮或冰箱与水浴锅距离较远，未采取适当的保冷措施，可能导致细胞在运输过程中开始融化（尤其是在夏季）。冻存细胞应放在干冰或冰盒上运输至水浴锅。

2. 在运输冻存管时，切勿用手触碰细胞部分或将其放入口袋中。应捏住管盖或将其放在容器中进行运输，以防局部温度升高导致细胞融化。

3. 错误融化细胞的方式也需避免，切勿用手捂热（搓热也不可行），手心温度不足会导致细胞受热不均匀，且降温速度过慢可能致使细胞死亡。

4. 在水浴时未严格控制时间，简单放入水中静置，而不进行摇晃，可能影响细胞复苏效果。遵循“快融”原则，建议2分钟内充分融化细胞，水浴时间越长活率越低。最佳方法是捏住管盖，快速摇晃管身，加速细胞融化，切忌将冻存管静置于水浴中。

5. 水浴结束时如管内仍有较大冰块未融化，将导致细胞死亡。冰块中的细胞会缓慢升温而致死，同时冰块会对已融化的细胞造成低温损伤。如果担心2分钟内无法完全融化，可以将水浴锅温度提高至39度（经实践证明可行），并加快摇晃速度。如有污染风险，建议将冻存管放在一次性PE手套内再进行水浴。

6. 细胞融化后若未进行离心以去除DMSO，可能会对细胞造成伤害。虽然一些良好的贴壁细胞在融化后可通过10倍培养基稀释后直接培养，但这种方法并不适用于长期培养及敏感的悬浮细胞。若不确定自己的细胞是否对DMSO敏感，离心去除上清将更加安全。

以上经验总结源自小尚多年的实践，结合冻存篇的内容，基本上能够解决所有复苏失败的问题。如果还有其他知识点未提及，欢迎同学们在评论区补充。为保证细胞复苏的成功率，选择尊龙凯时的产品将是您的明智之选。在细胞生物学研究中，尊龙凯时将为您提供全方位的支持和解决方案。